矮小癥和正常身高兒童的生長(zhǎng)激素刺激試驗(yàn)：免疫功能測(cè)定方法的使用
人類(lèi)GH釋放的晝夜節(jié)律使其難以精確和準(zhǔn)確鑒別其分泌不足狀態(tài)。因此，使GH分泌不足的診斷復(fù)雜起來(lái)，不僅需要評(píng)價(jià)兒童的身高、體重、生長(zhǎng)速度人體測(cè)量學(xué)變量，而且也要測(cè)量生長(zhǎng)因子的濃度，并要多次取血樣確定GH的濃度。GH刺激試驗(yàn)已成為估價(jià)矮小癥兒童GH狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)化處理方法。在大部分兒童，GH刺激試驗(yàn)也有助于評(píng)價(jià)GH治療的可能益處。在美國(guó)的調(diào)查說(shuō)明，80%以上的兒科內(nèi)分泌醫(yī)生常規(guī)使用GH刺激試驗(yàn)。但是，對(duì)刺激試驗(yàn)的正常反應(yīng)因依賴于所使用的測(cè)定方法和以特定方法建立的的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)問(wèn)題而難以捉摸。
最初GH刺激試驗(yàn)的研究以胰島素引起低血糖，后來(lái)使用精氨酸為刺激物，早期的研究確立正常兒童的GH峰值至少~5mg/ml，但使用豬MAb抗人GH的GH測(cè)定對(duì)這個(gè)數(shù)值提出了挑戰(zhàn)。單獨(dú)或結(jié)合使用其它促分泌素，例如心得安（propranolol）和L-多巴胺、精氨酸和L-多巴胺、氯亞定都得出了不同的結(jié)果。最近，在正常生長(zhǎng)的矮小癥兒童大樣本（n=472），對(duì)許多不同藥物刺激的GH反應(yīng)分析研究說(shuō)明，許多正常兒童未能刺激血清GH濃度，表現(xiàn)出的數(shù)值顯著低于慣例所采用的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值。但是，應(yīng)用GH釋放激素結(jié)合精氨酸或促生長(zhǎng)素抑制素的抑制劑培維索孟（pyridostigmine）時(shí)，最小的GH反應(yīng)也是高的（19ng/ml）。因此這些作者認(rèn)為，如果不使用如此強(qiáng)大的促分泌素，這些試驗(yàn)將不能區(qū)別GH分泌充足和不足的兒童。在最近20年內(nèi)，所確定的血清GH濃度峰正常值也有很大的不同，其范圍由5ng/ml至7ng/ml，又到最近10ng/ml。盡管缺乏特定標(biāo)準(zhǔn)值的適當(dāng)測(cè)定方法，但大部分美國(guó)內(nèi)分泌醫(yī)生未調(diào)整對(duì)刺激試驗(yàn)結(jié)果的解釋。實(shí)際上，在美國(guó)調(diào)查的兒科內(nèi)分泌醫(yī)生中，70%以上認(rèn)為診斷GH分泌不足的GH峰值為<10ng/ml。在研究工作中，大都多次采取血樣來(lái)估價(jià)GH的分泌方式，但多次采血樣似乎也不如評(píng)價(jià)為GH充足的刺激結(jié)果更準(zhǔn)確。
GH治療已發(fā)展為成年GH分泌不足的替代治療，其目的并非線性生長(zhǎng)，也同樣遇到了診斷正常和異常GH狀態(tài)的兩難境地。對(duì)于治療成年GH分泌不足病人的醫(yī)生，這是一個(gè)特別重要的問(wèn)題，因?yàn)椴幌裨趦和∪四菢佑袦y(cè)量身高和生長(zhǎng)速度優(yōu)勢(shì)。Hoffman et al.證明，有垂體疾病證據(jù)的成年人對(duì)胰島素引起低血糖的GH反應(yīng)峰明顯低于年齡、性別和BMI相匹配的正常受試者，所有正常受試者的GH峰>5ng/ml，所有GH分泌不足受試者<3ng/ml。與24-小時(shí)GH濃度譜或IGF-I、IGFBP-3濃度測(cè)量相比，胰島素引起的低血糖刺激實(shí)驗(yàn)也有最好的鑒別能力。這些研究和其它的數(shù)據(jù)產(chǎn)生了成年人GH分泌不足的最終試驗(yàn)推薦意見(jiàn)為，對(duì)胰島素引起低血糖的GH反應(yīng)峰值<3 ng/ml。
最近提出了一種高靈敏性的IFGH測(cè)定方法，這種測(cè)定方法使用了GH分子在兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)上結(jié)合兩種不同受體的概念，使用特異抗GH一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的重組GH結(jié)合蛋白（GHBP）和抗另一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的MAb，測(cè)量GH分子聚合兩受體的能力，因而測(cè)量產(chǎn)生生物信號(hào)的能力。我們進(jìn)行本研究，是要觀察新的IFGH測(cè)定方法與兩種靈敏的商業(yè)測(cè)定方法- DSL ELISA和Hybritech IRMA方法之間的關(guān)系。我們也再次研究了對(duì)正常身高兒童使用常規(guī)GH刺激試驗(yàn)并測(cè)量IGF-I、IGFBP-3和酸性不穩(wěn)定亞單位，構(gòu)建GH正常水平的問(wèn)題。分析了矮身高兒童臨床GH分泌不足的檢查，并與一組正常身高兒童的數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。
方法
本研究得到維吉尼亞大學(xué)Wolfson兒童醫(yī)院臨床研究評(píng)審委員會(huì)和學(xué)會(huì)評(píng)審委員會(huì)的批準(zhǔn)。
受試者：在告知并經(jīng)兒童及其父母同意后，作為矮身高（short stature，SS）和生長(zhǎng)遲緩評(píng)價(jià)的一部分，在門(mén)診募集了19名兒童（11男，8女），在試驗(yàn)前不知是否存在GH分泌不足。1名受試者在治療GH分泌不足，身高生長(zhǎng)已經(jīng)停止，在做重復(fù)刺激試驗(yàn)。因此，在試驗(yàn)時(shí)其身高SDS并不矮（身高SDS為0.7）。為了比較，也由醫(yī)療中心的職員當(dāng)中募集了13名健康兒童（5男，8女），都有正常的身高。表1為受試者臨床特征。
研究設(shè)計(jì) 矮身高兒童使用精氨酸/L-多巴胺或精氨酸/胰島素引起低血糖作為藥物刺激劑進(jìn)行GH刺激試驗(yàn)。在每時(shí)間點(diǎn)上多取血樣進(jìn)行如下述的額外測(cè)定。在整夜禁食后的清晨，受試者來(lái)到Wolfson兒童醫(yī)院臨床研究中心或維吉尼亞大學(xué)臨床研究中心，在應(yīng)用麻醉劑霜后，抽取血樣用于測(cè)定幾種激素。然后立即口服L-多巴胺（依體重不同，250或500mg），以0.5g/kg的劑量進(jìn)行10%鹽酸精氨酸30分鐘的輸液，在0，20，40，60，90和120分鐘取血樣用于測(cè)定GH濃度。并測(cè)量同一時(shí)間點(diǎn)的血漿IGF-I、IGFBP-3和ALS。采用精氨酸/胰島素引起低血糖試驗(yàn)的病人（n=6）在取樣60分鐘后，接受0.075 U/kg的胰島素，在120分鐘試驗(yàn)過(guò)程中多次采集血樣。在血漿葡萄糖濃度<40mg%時(shí)為血糖過(guò)低，僅1名受試者出現(xiàn)了胰島素引起的血糖過(guò)低。正常對(duì)照組兒童都采用精氨酸/L-多巴胺試驗(yàn)。
測(cè)定 使用DSL ELISA方法測(cè)定GH濃度。該方法是一種酶增雙抗夾心免疫測(cè)定，使用單克隆抗人-GH抗體，靈敏度為0.03ng/ml，測(cè)定批內(nèi)和批間變異系數(shù)（CV）分別為4%和6%。使用世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)（88/624）校對(duì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。
此外，使用以前提出的DSL IFGH方法測(cè)定GH分子在兩個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合能力的GH濃度。這種測(cè)定方法使用MAb抗GH分子結(jié)合位點(diǎn)2，以?；亟MGHBP結(jié)合GH的結(jié)合位點(diǎn)1。在孵化和洗滌后，以酰化重組GHBP孵化管壁，通過(guò)添加抗生蛋白鏈霉素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶捕獲GH分子的結(jié)合位點(diǎn)。因此測(cè)量的吸光度直接與占據(jù)兩個(gè)GH受體結(jié)合位點(diǎn)的有生物活性的完整GH濃度成比例，批內(nèi)和批間CV分別為3-5%和4-9%。依照WHO 88/624校對(duì)標(biāo)準(zhǔn)。
所有SS組的病人也都以IRMA方法測(cè)量GH濃度。測(cè)定使用兩種抗GH分子兩位點(diǎn)的MAb，靈敏度為0.2ng/ml，批內(nèi)和批間CV分別為3-4%和3-5%。正常對(duì)照組也以這種測(cè)定方法進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)使用國(guó)家衛(wèi)生研究所GH參照制劑HS2243E。
血漿IGF-I、IGFBP-3和ALS濃度使用DSL商業(yè)ELISA方法測(cè)量。
統(tǒng)計(jì)分析 使用參數(shù)t 檢驗(yàn)分析兩組所有測(cè)量生長(zhǎng)因子的差異。使用多元逐步回歸分析估價(jià)GH測(cè)定方法與其它生長(zhǎng)因子和人體側(cè)學(xué)指標(biāo)的關(guān)系，顯著性水平為 p<0.05。
結(jié)果
表2列出了本研究受試者的生長(zhǎng)因子和三種不同方法測(cè)定的GH濃度，并與正常對(duì)照組進(jìn)行了比較。無(wú)論使用免疫功能方法還是DSL ELISA方法,SS組的血清GH濃度相似，然而Hybritech測(cè)定方法始終較高。不管測(cè)定方法如何，組內(nèi)GH峰值高度相關(guān)（圖1）。SS組與對(duì)照組之間，每種方法測(cè)定的GH濃度（峰值或平均數(shù)）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但I(xiàn)FGH對(duì)DSL ELISA GH的曲線斜率（0.98）明顯大于DSL ELISA GH對(duì)Hybritech IRMA GH（0.68）或IFGH對(duì)Hybritech GH的斜率（0.65），說(shuō)明Hybritech IRMA方法測(cè)定的GH分子與DSL ELISA和IFGH方法不同。有趣的是，正常對(duì)照組測(cè)定的GH濃度范圍寬大，在13名兒童中，應(yīng)用不同測(cè)定方法測(cè)定的GH峰值<7ng/ml的兒童例數(shù)不同，使用IFGH方法有11名，使用DSL ELISA方法有6名，在使用常規(guī)Hybritech IRMA方法的9名兒童中有4名。實(shí)際上，在13名正常身高兒童中，使用常規(guī)DSL ELISA方法有46%的或6名兒童的GH水平<5ng/ml，使用Hybritech IRMA方法的9名兒童中有3名（33%）GH水平<5ng/ml（圖2）。這些數(shù)據(jù)范圍是在青春期前和青春期少年受試者所觀察到的。在以胰島素引起低血糖刺激試驗(yàn)的受試者也同樣觀察到了較低的GH峰值。
但是，SS組的血漿IGF-I、IGFBP-3、ALS的實(shí)際濃度或SDS始終低于對(duì)照組，甚至在將小于6歲的4名兒童排除后，這種差異依然存在。
在SS組進(jìn)行多元回歸分析以評(píng)價(jià)對(duì)刺激試驗(yàn)GH反應(yīng)峰值（IFGH和ELISA方法）之間的關(guān)系，分析數(shù)據(jù)列于表3。在IFGH或ELISA的GH濃度峰值與血漿IGF-I、IGFBP-3、ALS濃度之間，在IFGH或ELISA GH濃度與身高SDS、BMI、生活年齡、線性生長(zhǎng)速度之間的相關(guān)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
討論
研究表明，SS組和正常兒童組IFGH方法與常規(guī)方法測(cè)定的GH高度相關(guān)，即使IRMA方法對(duì)矮身高兒童的測(cè)定值始終較高，但DSL ELISA和Hybritech IRMA方法相互之間以及與IFGH測(cè)定方法密切相關(guān)。這些數(shù)據(jù)提示，在所研究的大部分受試者中IFGH測(cè)定方法并不比ELISA方法優(yōu)越很多，說(shuō)明所檢驗(yàn)的測(cè)定方法（標(biāo)準(zhǔn)的DSL ELISA或Hybritech IRMA方法）能夠準(zhǔn)確檢測(cè)生物活性分子。
以前曾經(jīng)報(bào)告SS由GH無(wú)生物學(xué)活性所引起，以高循環(huán)GH濃度為特征，缺乏GH作用，在給外源性GH后出現(xiàn)顯著的趕上生長(zhǎng)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這種狀況與GH-1基因突變有關(guān)，GH基因突變不僅不能刺激酪氨酸的磷酸化，而且還具有拮抗作用。確定是否存在免疫功能/免疫測(cè)定濃度比例異常的特發(fā)性SS病人（提示GH無(wú)生物活性），可能還需要以這兩種測(cè)定方法在其它方面正常的特發(fā)性SS兒童大樣本中進(jìn)一步的研究。
本文所研究的正常身高的兒童使用了精氨酸與L-多巴胺或精氨酸與胰島素引起低血糖刺激GH分泌，許多兒童對(duì)刺激的GH反應(yīng)峰值低于慣例認(rèn)可的界值點(diǎn)，使用DSL ELISA 或Hybritech IRMA方法測(cè)定，約50%的正常兒童峰值<7ng/ml，33-46%的兒童（使用Hybritech IRMA或DSL ELISA測(cè)定方法)低于5ng/ml。事實(shí)上，兩名青春期發(fā)育完全正常的受試者GH濃度峰值在2ng/ml（使用IFGH和DSL ELISA GH方法）。總之，本研究和其它研究數(shù)據(jù)支持兒童GH刺激試驗(yàn)不能準(zhǔn)確確定分泌不足的觀點(diǎn)，除非GH水平很低（2ng/ml），使用通用的促分泌素和當(dāng)代靈敏性的測(cè)定方法評(píng)價(jià)矮身高兒童時(shí)，武斷的10、7、5ng/ml界值點(diǎn)無(wú)應(yīng)用價(jià)值。但是，如果使用更強(qiáng)力的刺激（例如GH釋放激素和培維索孟）能夠較好地區(qū)分分泌不足和充足。
另一方面，循環(huán)生長(zhǎng)因子測(cè)量表現(xiàn)出有趣的趨勢(shì)。甚至在排除SS組小年齡兒童進(jìn)行分析時(shí)，SS組的IGF-I、IGFBP-3、ALS濃度總體上低于正常對(duì)照組。因?yàn)樗羞@些肽類(lèi)都有GH依賴性，所以正常兒童的濃度明顯高于SS組的事實(shí)說(shuō)明，測(cè)定這些生長(zhǎng)因子可能比GH刺激試驗(yàn)更能夠鑒別兒童GH分泌不足，這種原則得到了其它研究的支持。
使用3種方法測(cè)定的刺激實(shí)驗(yàn)GH反應(yīng)峰值與普遍使用的身高、BMI、年齡、生長(zhǎng)速度、IGF-I、IGFBP-3、ALS等人體側(cè)學(xué)指標(biāo)之間無(wú)相關(guān)，使其難以更好地預(yù)測(cè)GH治療時(shí)的線性生長(zhǎng)潛力。
據(jù)估計(jì)，美國(guó)42%的GH治療兒童無(wú)典型的GH分泌不足，但是，其中有許多特發(fā)性SS兒童，GH增加線性生長(zhǎng)和最終身高的效果確實(shí)不那么顯著。因此，確立正確診斷兒童GH分泌不足的標(biāo)準(zhǔn)所節(jié)約的財(cái)力是大量的。其它方面正常，IGF-I、IGFBP-3和ALS濃度正常而在5%百分位數(shù)上生長(zhǎng)的SS兒童不需要GH刺激試驗(yàn)，無(wú)CNS癥狀時(shí)也不需要后來(lái)的腦部磁共振成像。對(duì)于有低濃度循環(huán)生長(zhǎng)因子和生長(zhǎng)不良的兒童才應(yīng)當(dāng)進(jìn)行GH刺激試驗(yàn)。
總之，在矮身高兒童GH刺激試驗(yàn)中使用新的IFGH測(cè)定方法與標(biāo)準(zhǔn)的GH DSL ELISA 和Hybritech IRMA方法高度相關(guān)，提示這些當(dāng)代GH免疫測(cè)定方法大都能夠檢測(cè)產(chǎn)生的生物學(xué)信號(hào)。我們也證明，正常身高兒童GH濃度的增長(zhǎng)可能達(dá)不到2ng/ml以上，而卻有正常的依賴GH的生長(zhǎng)因子循環(huán)水平。這些數(shù)據(jù)也說(shuō)明，對(duì)通用刺激的GH反應(yīng)峰值的異常標(biāo)準(zhǔn)是否是10、7、或是5ng/ml，仍然有待于研究。
我們結(jié)論為，正常GH刺激試驗(yàn)結(jié)果可能比以往公認(rèn)的數(shù)值低許多。依賴GH的生長(zhǎng)因子可能是比刺激的GH濃度更敏感的GH分泌不足指征。
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