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生長(zhǎng)學(xué)是臨床診斷未知病因矮身高兒童SHOX單倍體不足的重要方法


時(shí)間: 2017/2/22 14:18:52 瀏覽量:2747 字號(hào)選擇: 分享到:

摘要:在某些特發(fā)性矮身高和許多萊里-韋爾(Leri-Weill)軟骨骨生成障礙病人,SHOX(short stature homeobox-containing gene)突變引起單倍體不足(haploinsufficiency)。約80%的SHOX 突變?yōu)榛蛲耆笔?,其余的為各種點(diǎn)突變。本文目的為估價(jià)特發(fā)性矮身高兒童SHOX突變的發(fā)生率,提出單倍體不足的表型特征。我們募集了140名特發(fā)性矮身高兒童(61女)。特發(fā)性矮身高的定義為,有正常IGF-I和自由睪酮、女性有正常的核型,無肌內(nèi)膜抗體、長(zhǎng)期器質(zhì)性、心理性或綜合癥疾病,并且無明顯的骨發(fā)育異常征兆。測(cè)量記錄身高、臂展、坐高,計(jì)算坐骨下腿長(zhǎng)。以熒光引物PCR擴(kuò)增SHOX編碼區(qū)域附近兩個(gè)高度多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記(CA-SHOX 重復(fù)和DXYS233),并以自動(dòng)測(cè)序儀分離。對(duì)每一標(biāo)記僅有1個(gè)片段大小的淵源者分析父母的DNA。在三個(gè)淵源者(2%)證實(shí)了由SHOX缺失引起的SHOX單倍體不足,三名病人都為女性,攜帶有父親等位基因的全部缺失。與其它137名檢測(cè)的兒童相比,臂、腿顯著縮短而有低-正常的坐高。因此,3名SHOX單倍體不足淵源者的肢體/軀干比例(腿長(zhǎng)與臂展之和除以坐高)顯著低于全組病人。這個(gè)觀察結(jié)果得到另外5名以前診斷為SHOX單倍體不足病人(4女)生長(zhǎng)學(xué)數(shù)據(jù)的證實(shí),除了一名年齡最小的女孩外,以身高調(diào)整的肢體/軀干比例低于平均數(shù)1SD以上。所有SHOX單倍體不足的兒童至少表現(xiàn)出一種萊里-韋爾軟骨骨生成障礙的X線表現(xiàn)特征——遠(yuǎn)側(cè)橈骨骺三角形化、遠(yuǎn)側(cè)排腕骨的錐體化、橈骨遠(yuǎn)側(cè)尺骨端透明。我們的觀察提示,可以肢體/軀干比例低于1.95+1/2身高(m)和手腕X線片的重要判斷篩選SHOX突變的兒童。

(J Clin Endocrinol Metab 88: 4891–4896, 2003)


在某些特發(fā)性矮身高(idiopathic short stature,ISS)和許多Leri-Weill軟骨骨生成障礙(Leri-Weill-dyschondrosteosis,LWD)病人,已經(jīng)報(bào)告了引起單倍體不足的擬常染色體SHOX(矮身高同源框基因)雜合性突變。Leri-Weill軟骨骨生成障礙是一種骨軟骨發(fā)育不良癥,有肢中性矮身高和腕部馬德隆畸形表現(xiàn)。由妊娠第二個(gè)月,SHOX開始在人類胚胎成骨細(xì)胞中表達(dá)。選擇性剪接生成兩種蛋白,其中非截短的SHOXa引起體外基因轉(zhuǎn)錄。在骨的個(gè)體發(fā)生、骨代謝和生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)中,它的確切作用尚不了解。約80%的SHOX突變?yōu)橥耆蛉笔?,其余為點(diǎn)突變。除了不成比例的矮身高外,LWD病人的常見征兆為肘外翻,高腭穹和脊柱側(cè)凸,與在染色體畸變基礎(chǔ)上有SHOX缺失的特納綜合征女性的部分表型相類似。甚至在同一家庭,SHOX單倍體不足的表型高度可變,說明了較差的基因型-表型關(guān)系。最初,在一名特發(fā)性矮身高兒童發(fā)現(xiàn)SHOX突變提出了兩個(gè)問題:1)迄今有多少未知病因(特發(fā)性)的矮身高兒童有SHOX單倍體不足?2)在臨床上能夠識(shí)別表型嗎?最近,Rappold et al.報(bào)告了特發(fā)性矮身高兒童SHOX缺陷的發(fā)生率,但研究中未排除父母有馬德隆畸形的個(gè)體,也無生長(zhǎng)學(xué)和放射學(xué)確切數(shù)據(jù)。與此相反,其它兩個(gè)研究組未發(fā)現(xiàn)特發(fā)性矮身高兒童的SHOX缺陷,而是在矮身高和LWD的幾名淵源者發(fā)現(xiàn)有SHOX缺陷。


在本文中,我們報(bào)告了140名具有特發(fā)性矮身高特征的兒童所進(jìn)行的SHOX缺失篩查結(jié)果。在此基礎(chǔ)上,我們提出特發(fā)性矮身高學(xué)齡兒童生長(zhǎng)學(xué)判斷方法,在骨骼生長(zhǎng)不成比例個(gè)體中確定SHOX分子學(xué)分析的候選者。而且也討論了特定X線表現(xiàn)的作用。


受試者和方法


個(gè)體


為了SHOX缺失篩查,由我們生長(zhǎng)研究中心3名有經(jīng)驗(yàn)的兒科內(nèi)分泌醫(yī)師募集了140名(61女)特發(fā)性矮身高兒童。年齡范圍在2.6~16.1歲(中位數(shù)9.1歲)。特發(fā)性矮身高定義為:IGF-I和自由T4正常,女性核型正常,無肌內(nèi)膜抗體,無長(zhǎng)期器質(zhì)性、心理性或畸形疾病,無明顯骨發(fā)育不良征兆(包括馬德隆畸形)。這些標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)于特發(fā)性矮身高定義共識(shí)。記錄身高、臂展和坐高,計(jì)算坐骨下腿長(zhǎng)。經(jīng)證實(shí)為SHOX的淵源者要在我們?cè)\所再次檢測(cè),并再次拍攝左手腕X線片。也再次分析了10名肢體最短、無SHOX缺失的淵源者。此外,再次回顧性分析我們?cè)\所以前檢測(cè)出的SHOX單倍體不足兒童(n=5)的生長(zhǎng)學(xué)和放射學(xué)數(shù)據(jù)。


所有SD分值依據(jù)荷蘭標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算。有所有兒童和/父母得到知情同意書。


方法


由血液淋巴細(xì)胞提取基因組DNA。使用熒光引物PCR擴(kuò)增位于Xp22.3前后和SHOX基因座的兩個(gè)高度多態(tài)性微衛(wèi)星,并以自動(dòng)測(cè)序儀器分離。以SHOX末端定位CA-SHOX重復(fù),DXYS233周圍300–350 kb位于SHOX近側(cè)。如果二者端粒標(biāo)記(DXYS233, CA-SHOX 重復(fù))之一僅有1個(gè)片段大小,則進(jìn)行父母DNA分析。這種分析能夠使我們區(qū)分純合子(相同大小的兩等位基因)與半合子(缺失一個(gè)等位基因)。


統(tǒng)計(jì)學(xué)分析


在所有生長(zhǎng)學(xué)參數(shù)正態(tài)分布的基礎(chǔ)上,當(dāng)3名SHOX缺失兒童的數(shù)值在無SHOX缺失兒童組95%置信區(qū)間之外時(shí),為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。使用JMO 4.0.5版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。


結(jié)果


通過位于SHOX基因座和2個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的擴(kuò)增,在11名淵源者(7%)發(fā)現(xiàn)2標(biāo)記僅有單一片段,提示了半合子或純合子SHOX基因座。在11名淵源者中,僅8名有父母DNA,但有2名是不提供信息的。通過父母等位基因擴(kuò)增,在3名女孩(2%)證實(shí)了SHOX缺失的半合子(圖1)。通過以前報(bào)告的3個(gè)常染色體標(biāo)記的擴(kuò)增證明為父系。不提供信息的以及缺少父母DNA的5名淵源者未排除SHOX缺失。



3名受累淵源者的生長(zhǎng)學(xué)特征為短坐骨下腿長(zhǎng)、短臂展但有低-正常的坐高(相對(duì)于年齡)。為進(jìn)一步分析這一結(jié)果,我們將其與其它SHOX缺失陰性的137名淵源者的生長(zhǎng)學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較(表1和圖2A-C)。3名受累淵源者的靶身高和體重(年齡的SDS)在未受累組的95%的置信區(qū)間之內(nèi),但SHOX缺失女孩的骨骼比例與無SHOX缺失淵源者顯著不同。證實(shí)了骨不成比例是一個(gè)特殊的表現(xiàn)(表1)。當(dāng)依身高繪制臂展、腿長(zhǎng)和坐高圖時(shí)(圖2A-C),這種表現(xiàn)也同樣明顯。



為了將骨不成比例的相關(guān)數(shù)據(jù)整合為一項(xiàng),我們確定了一項(xiàng)生長(zhǎng)學(xué)比值,將肢體與軀干長(zhǎng)度相比較(下面稱為及肢體/軀干比)。肢體/軀干比的定義為,(坐骨下腿長(zhǎng)+臂展)/坐高。因此,有高肢體/軀干比為不成比例短肢體的矮身高兒童。圖3為所有淵源者依身高的肢體/軀干比。該圖示強(qiáng)調(diào)了在所有研究的特發(fā)性矮身高兒童中,3名SHOX缺失淵源者的骨不成比例(實(shí)心圓)的高度特殊性表現(xiàn)。肢體/軀干比例直線隨年齡和身高而增加,反應(yīng)了兒童期,臂和腿生理性生長(zhǎng)的速度高于軀干。


因此,我們的數(shù)據(jù)提示,在特發(fā)性矮身高兒童亞組篩查SHOX突變是最合理的,即篩查那些有低肢體/軀干比例表現(xiàn)的特發(fā)性矮身高兒童。如果篩查上限定義為肢體/軀干比例低于身高調(diào)整的平均數(shù)下1SDS,那么這樣的生長(zhǎng)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)可使約84%的矮身高兒童免于遺傳學(xué)篩查檢測(cè)。近似計(jì)算為小于1.95+1/2身高(m),即圖3中的點(diǎn)線。為了檢驗(yàn)這樣一種篩查方法的敏感性,我們搜集了所有突變篩查中被排除的SHOX單倍體不足兒童的數(shù)據(jù)(n=5,4女),被排除的病人為有明顯馬德隆畸形(4號(hào)病人),Rao et al.報(bào)告的已知SHOX無義突變(5和6號(hào)病人),以及含有SHOX基因座的Xp末端著絲粒缺失(7和8號(hào)病人),表2。所有SHOX單倍體不足學(xué)齡兒童的肢體/軀干比例都低于這一限度,說明在這一組SHOX單倍體不足學(xué)齡兒童,篩查方法有高度敏感性(100%),圖3。但是,骨不成比例的程度不同,該組中有一名年齡最小、身高最矮的兒童(5號(hào)病人)有較低而正常的肢體/軀干比例(身高2510px下2.51),但在一段時(shí)間后,下降到了低點(diǎn)(身高3132.5px下的2.45)。在她的受累的哥哥(6號(hào)病人),也觀察到隨時(shí)間的進(jìn)展骨不成比例程度加大(身高2927.5px時(shí)為2.50,在身高3615px時(shí)為2.48)。





因此,根據(jù)我們的數(shù)據(jù),在檢測(cè)SHOX單倍體不足學(xué)齡兒童時(shí),上述定義的肢體/軀干低于1.95+1/2身高(m)有100%的敏感性和85%的特異性。如果矮身高兒童SHOX單倍體不足發(fā)生率為2%,那么肢體/軀干比例小于1.95+1/2身高(m)矮身高學(xué)齡兒童有SHOX單倍體不足的可能性為12%(檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值)。更有趣的是,在身高110cm以上,肢體/軀干比例在1.95+1/2身高(m)之上的矮身高學(xué)齡兒童100%的沒有SHOX單倍體不足(陰性預(yù)測(cè)值)。但是(如5號(hào)病人),學(xué)齡前兒童以及矮于110cm的兒童,這個(gè)檢驗(yàn)有較低的敏感性和特異性,要小心應(yīng)用。


最后,本研究中的三名SHOX缺失淵源者以及其它以前檢出SHOX單倍體不足的5名病人常規(guī)左手腕X線片異常,表現(xiàn)出LWD的特征:遠(yuǎn)側(cè)橈骨三角形化(88%),遠(yuǎn)側(cè)排腕骨椎體化(88%)和橈骨的遠(yuǎn)側(cè)尺骨側(cè)透X光。因?yàn)槲覀兊倪z傳學(xué)方法未能檢測(cè)所有可能的SHOX缺失和SHOX點(diǎn)突變,所以我們?cè)跓oSHOX缺失淵源者組也分析了10名有最低肢體/軀干比例病人的手腕X線片。有趣的是,10名病人中有1名女性有輕微馬德隆畸形表現(xiàn),可能是由于未檢測(cè)出的點(diǎn)突變,或是其它未知基因突變引起LWD。此外,10名病人中,2名兒童(3.8歲和5.5歲)屬于SHOX標(biāo)記僅有單一片段大小的5名病人組,他們的父母DNA不可提供信息或是沒有樣本。


討論


SHOX是影響生長(zhǎng)的重要基因,它的發(fā)現(xiàn)提出了一個(gè)問題,該基因多大程度的突變貢獻(xiàn)于以前所診斷的特發(fā)性的矮身高。與特發(fā)性寬大的定義不同,最近的一個(gè)專家會(huì)議詳細(xì)定義了特發(fā)性矮身高,并由定義中排除了異常身體比例的兒童。定義的理論根據(jù)將寬大范圍的骨軟骨發(fā)育不良排除在特發(fā)性矮身高術(shù)語之外。但是,不要忘記,對(duì)矮身高所進(jìn)行的生長(zhǎng)學(xué)評(píng)價(jià)并不全面,常常為臨床觀察所代替,可能忽視輕微的骨不成比例。


本文結(jié)果與以前的未知病因特發(fā)性矮身高兒童常見SHOX突變的研究相一致,估價(jià)的發(fā)生率至少1-2%??紤]到有一定百分?jǐn)?shù)的SHOX突變個(gè)體并非矮身高,SHOX突變的檢測(cè)尚不完全,總?cè)巳褐蠸HOX突變發(fā)生率至少為1:4000似乎是可靠的估計(jì)。因此, 很可能SHOX突變比成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)3突變更為多見,估計(jì)軟骨發(fā)育不全的發(fā)生率在1:15000和1:40000之間,然而,F(xiàn)GFR3突變引起的軟骨發(fā)育不良和某些罕見的骨發(fā)育不全的發(fā)生率還不清楚。


因SHOX單倍不足有高發(fā)生率,所以確定及早診斷矮身高兒童的標(biāo)準(zhǔn)是重要的,特別是在證明了重組GH能有效促進(jìn)生長(zhǎng)的情況下。通過搜集所研究?jī)和械纳L(zhǎng)學(xué)數(shù)據(jù),我們觀察到,與陰性篩查結(jié)果相比,所有SHOX單倍體不足學(xué)齡兒童有明確的不成比例的臂和腿的縮短。其它研究者也觀察到了相似的SHOX單倍體不足所引起的骨不成比例,但是,因?yàn)樗械臏Y源者為L(zhǎng)WD家庭成員,他們搜集的數(shù)據(jù)有偏差。通過整合3個(gè)普遍使用的生長(zhǎng)學(xué)指標(biāo),骨不成比例可定量為一項(xiàng),我們稱其為肢體/軀干比例,可直接將肢體長(zhǎng)度(坐骨下腿長(zhǎng)+臂展)與軀干長(zhǎng)度(坐高)相比較。我們的數(shù)據(jù)提示,在以身高調(diào)整的低肢體/軀干比例 [<1.95 + 1/2 height (m)] 矮身高學(xué)齡兒童中,SHOX突變的可能性約為12%。另一方面,正?;蚋叩闹w/軀干比例排除了SHOX突變。在身高低于110cm的學(xué)齡前兒童,這個(gè)規(guī)律是不可靠的,因?yàn)镾HOX單倍體不足引起的骨不成比例尚未充分地顯現(xiàn)。


最近,Rappold et al.報(bào)告了矮身高兒童的突變篩查,檢測(cè)出6名功能性SHOX突變。在4名有骨骼變形資料的兒童中,3名骨不成比例。但是,未列出身體比例的生長(zhǎng)學(xué)數(shù)據(jù)。在最早發(fā)現(xiàn)SHOX的報(bào)告中,兩兄弟攜帶無義突變,也并入本文中的受累對(duì)照組(5,6號(hào)病人)中。在6歲和8歲時(shí)他們最初被診斷為特發(fā)性矮身高。在一段時(shí)間內(nèi),二者都出現(xiàn)了骨不成比例,完全符合LWD的診斷。因此,低年齡兒童的臨床診斷是困難的,特別是在骨不成比例尚未出現(xiàn)的學(xué)齡前兒童。就像在LWD家庭中一樣,所謂的特發(fā)性矮身高組中,男性較少(本研究中3名女性,無男性,參考文獻(xiàn)2中5名女無男),但兩篩查組中男性較多(56%和60%)。因此,其它研究中的女性發(fā)生率不是篩查偏差的問題,而更可能是至今未知的基礎(chǔ)機(jī)制的結(jié)果。


除了生長(zhǎng)學(xué)外,由常規(guī)左手X線片形態(tài)學(xué)分析可以得出二線證據(jù)。雖然僅一名對(duì)照受累病人存在馬德隆畸形,但我們?cè)谒?名SHOX單倍體不足兒童檢查出了輕微LWD腕發(fā)育異常特征。橈骨遠(yuǎn)側(cè)尺側(cè)緣的透明是LWD引起腕異常的早期特殊征兆,但是僅出現(xiàn)于半數(shù)受累兒童之中。相比之下,在除一名年幼兒童外,所有SHOX單倍體不足兒童都存在橈骨三角形化和腕骨錐形化。Ross et al.發(fā)現(xiàn),在SHOX單倍體不足的LWD家庭的42名淵源者中,僅有74%的受試者有類似于馬德隆畸形的腕骨放射學(xué)異常。但是,在馬德隆畸形陰性的9名淵源者中,7名兒童的年齡在9歲以下。因此,他們的腕骨、橈骨骨化尚未達(dá)到能詳細(xì)進(jìn)行放射學(xué)評(píng)價(jià)的程度。Schiller et al.報(bào)告了SHOX單倍體不足成年人的馬德隆畸形的臨床和放射學(xué)表現(xiàn),強(qiáng)調(diào)了兒童期馬德隆畸形的最初征兆,例如腕部楔形是X線唯一可檢測(cè)的特征??傊?,絕大部分SHOX單倍體不足病人可能出現(xiàn)馬德隆畸形。兒童期放射學(xué)診斷的缺點(diǎn)是橈骨骺骨化尚不充分,在女孩骨齡9歲、男孩骨齡11歲才足以能夠診斷。因此,如果SHOX突變?yōu)榉峭耆笔У?,?yīng)當(dāng)進(jìn)行受累父母的放射學(xué)(臨床)分析。


結(jié)論,我們的遺傳學(xué)和臨床分析說明,SHOX單倍體不足引起典型的骨不成比例和腕部異常,對(duì)絕大部分學(xué)齡兒童進(jìn)行詳細(xì)的生長(zhǎng)學(xué)和放射學(xué)分析即可鑒別。應(yīng)對(duì)肢體/軀干比例不足1.95 + 1/2 身高 (m)的矮身高學(xué)齡兒童進(jìn)行SHOX突變篩選。如果骨成熟度達(dá)到并有放射學(xué)經(jīng)驗(yàn)情況下,篩查目標(biāo)組可以進(jìn)一步縮小到有馬德隆畸形放射學(xué)征兆的兒童。SHOX單倍體不足表型類似于所有程度的LWD,似乎比FGFR3突變引起的矮身高表型更為常見。


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